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PCR反应步骤、条件及原理

2009-11-28365必发娱乐:检验世界网 阅读: 【字号:
导读: DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链,在DNA聚合酶与引发子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链,在DNA聚合酶与引发子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做引发子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

PCR反应步骤  
    类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:

1、 模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

2、模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

3、引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的"半保留复制链",而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

Taq DNA 聚合酶
  现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 是于1976年从 温泉中的细菌(Thermus aquaticus)分离出来的。发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。

PCR的反应动力学

  PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA 片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期, 即出现"停滞效应" 这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。

标准的PCR反应体系
       10×扩增缓冲液    5ul
       4种dNTP混合物    各200μmol/L
       引物          各10~100pmol 
       模板DNA        0.1~2μg 
       Taq DNA聚合酶     1~2 U
       Mg2+          1.5~2.0mmol/L
       加双或三蒸水至     50μl

(必发365娱乐:admin)

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