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基因诊断的对象与方法

2009-11-12365必发娱乐:检验医学在线 阅读: 【字号:
导读: 目前看来,绝大多数疾病的,发展都与患者背景或者其改变有关,所以临床上越来越有必要检查这种变化。这种用方法检测患者体内遗传物质的水平或结构变化而作出的或辅助临床诊断的技术,称为基因诊断。

      医生需要综合患者的病史,症状,及各种检查的结果作出临床诊断。随着人们对疾病的病因及发理的认识的不断深入,临床检查的手段也在不断进步。目前看来,绝大多数疾病的,发展都与患者背景或者其改变有关,所以临床上越来越有必要检查这种变化。这种用方法检测患者体内遗传物质的水平或结构变化而作出的或辅助临床诊断的技术,称为基因诊断。

  一、基因诊断的对象

  1、病物的侵入:一般侵入体内的病原生物可通过检查各免疫学方法进行诊断。但是,直接检测病原生物的遗传物质可以大大提高诊断的敏感性。而肝在无法得到商业化抗体时,基因诊断就成为检测病原感染,尤其是感染的唯一手段。此外,由于基因碱基配对原理的基因诊断可直接检测病原微生物的遗传物质,所以诊断的特异性也大为提高。目前,基因诊断已在,受滋病等传染病的诊断中发挥了不可代替的作用。

  2、遗传性疾患:已有多种传统的遗传性疾患的发病原因被确定为特定基因的突变。例如:苯丙氨酸羟化酶基因突变可引起:腺苷脱胺酶基因突变可引起重症联合免疫缺陷症(SCID);而表面分子CD40或其配体(CD40L)基因突变则可引起无血症。这类疾病的诊断除了仔细分析临床症状及检查结果外,从病因角度作出诊断则需要用基因诊断的方法检测其基因突变的发生。此外,有些病因尚不清楚的疾病,如高血压、自身免疫性疾病等,都可能与某个或某些遗传位点的持有或改变有并。用基因诊断的方法检测这些位点的改变,不仅对临床诊断,而且对疾病的病因和发病机理的研究都具有重要的意义

  3、后天基因突变引起的疾病:这方面最典型的例子就是肿瘤。虽然肿瘤的发病机理尚未完全明了,但人们可以初步认为肿瘤的发生是由于个别基因突变而引起的细胞无限增殖。无论是抑发生突变还是癌基因发生突变,如果确定这些改变的发生,都必须进行基因诊断。

  4、其它:如指纹、个体识别,亲子关系识别,法医物证等。

   二、基因诊断的方法

  与疾病相关的遗传背景改变主要有两类,一是遗传物质,即DNA或RNA的水平的变化。例如病毒感染量病毒基因及其产物在人体内的从无到有,某些肿瘤中癌水平的从低到高。二是遗传物质的结构变化,即基因突变,如点突变引起的基因失活,及转位引起的基因激活或灭活等等。所以从理论上说所有检测基因水平或结构的方法都应可用于基因诊断。但如考虑其临床适用性,灵敏度等问题,下列几种方法可看作是有应用前景的基因诊断的方法。

  1、杂交:酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开,而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行,因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交(Southern blot hybridization )和RNA印迹杂交(Northern blot hybridization)。其基本过程包括下列几个步骤。

  (1)制备样品:首先需要从待检测组织样品提取DNA或RNA。DNA应先用限制性内切酶以产生特定长度的片段,然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱,所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后,直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离,然后转印并交联固定。

  (2)制备探针:探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡。在核酸杂交实验中,探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。这样,通过检疫与恩印膜上的核酸分子结合上的探针分子,既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置,也就是在电泳凝胶上的位置,也就知道了它的分子大小。

  (3)杂交:首先要进行预杂交,即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子,所以杂交过程中只需变性标记好的探针,再让探针与膜在特定的温度下反应,然后洗去未结合的探针分子即可。

  (4)检测:检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置;而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。

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