当前位置: 365必发娱乐 > 检验医学 > 分子生物学 > 正文
关注:

PCR技术发展历程及应用现状

2010-03-10365必发娱乐:本站综合 阅读: 【字号:
导读: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 由美国科学家PE(Perkin Elmer珀金-埃尔默)公司遗传部的Dr. Mullis发明,由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义,因此Mullis获得了1993年化学诺

一、PCR概述
1、什么是PCR
    聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 由美国科学家PE(Perkin  Elmer珀金-埃尔默)公司遗传部的Dr. Mullis发明,由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义,因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。
2、PCR技术发展史
    PCR原理是由一对引物介导,能在动植物体外对特定基因(DNA)片断进行快速酶促扩增,经过n个热循环扩增,扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n(0<E<1,扩增效率=倍,使得检测扩增产物中的特定基因成为可能。
聚合酶链式反应自从1993年到现在很快经历了四代产品:
 Ø       第一代:手动/机械手式水浴基因扩增
如上图所示,用三个恒温水浴箱,分别将三个水浴温度恒定在三个温度:PCR的高温变性温度(如94℃)低温复性温度(如58℃),适温延伸温度(如72℃)。再用一个装有PCR标本试管的提篮,用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴,标本在每个水浴箱中恒温的时间用秒表计时。这样PCR标本就能完成下述形式的热循环:
94℃ 30S       58℃ 45S       72℃  60S
          40次循环
    这种方法的特点是:实验人员劳动强度大,容易因疲劳引起差错;而优点是:设备简单,投资少,与自动化基因扩增仪相比,它无须升降温过程,实验时间短,试验更接近理想PCR反应条件,事实表明实验效果还是不错的,但由于标本试管从一个水浴箱往另一个水浴箱移动中要较短暂暴露于空气中,因此如移动速度不够快时也会对标本形成温度干扰,影响结果。本方法的另外一些缺点包括只能局限三个温阶(某些PCR反应需要多于三个温阶)、液体污染以及在低气压地区水温难以烧到94℃变性温度等。
    为改进提高本方法的自动化水平,有人设计了机械手装置,替代上述手工移动标本过程,形成了机械手水浴式基因扩增仪,该改进解决了实验人员的高强度劳动问题,但又带来了一个机械手部件大行程频繁相对运动而引起的高故障。这种类型的基因扩增仪在九十年代中期我国北京、上海有定型的产品销售,应用也较广,曾为我国的分子生物学的发展做出过积极贡献,而后便逐步被自动化程度更高的扩增仪替代,现在很少有单位使用。
 Ø    第二代:自动化控制型定性基因扩增仪
    与上述水浴式扩增仪相比,也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪,它是最具代表性的扩增仪,包括后续介绍的第三代、第四代都是以第二代为基础集成了定量检测部分。
 Ø    第三代:终点定量/半定量
    第二代的定性PCR只能判断阴性阳性,而无法评价特定核酸的浓度及定量分析,定量PCR至少能达到定性PCR无法实现的下列功能:
  •潜伏期病毒浓度探测
  •感染程度
  •致病病原体数量变化测定
  •抗病毒药物疗效评估
  •恢复期病毒载量检测
    自从1996年美国ABI公司发明第一台荧光定量PCR仪以来,PCR技术和应用从定性向定量快速发展.终点定量PCR的优点是设备投资少,对于国内经济条件还不能购买昂贵实时荧光定量PCR仪的科研单位和医疗机构,利用现有的第二代常规定性PCR仪,在添加一台专用的单孔PCR终点产物荧光定量检测仪便可开始工作,起到定量的作用。终点定量PCR技术是从定性向实时定量过渡的一个中间产品,而PCR终点产物荧光定量仪进口产品较少,国产仪器较多,如西安天隆的TL988,上海棱光的DA620型等
     第四代:实时定量PCR
    实时定量QPCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件,构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。
见下图:(略)
(必发365娱乐:admin)

------分隔线----------------------------

检验医学医学检验 POCT 考试大纲 DNA HE4 PCR OD值 CV值 PCT 血液 检验结果 乙肝 PSA 健康 贫血 疾病
Baidu