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AFLP技术原理、操作步骤及特点

2010-10-24365必发娱乐:本站综合 阅读: 【字号:
导读: AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术是一项新的分子标记技术,是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段,基因组DNA先用限制性内切酶切割,然后将双链接头连接到DNA片段的末端,接头序列和相邻的限制性位点序列,作为引物结合位点。限制性片段

AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术是一项新的分子标记技术,是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段,基因组DNA先用限制性内切酶切割,然后将双链接头连接到DNA片段的末端,接头序列和相邻的限制性位点序列,作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生,一种是罕见切割酶,一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点,具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带,而在另一品种中可能无此谱带产生,因此,这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。

  AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段。可以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。
AFLP反应流程
  AFLP反应程序主要包括模板DNA制备,酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有:

  首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA,选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。

  酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接,形成带有接头的特异性片段。

  DNA片段的预扩增。

  在Taq聚合酶的作用下,完成AFLP的选择性扩增。

  PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。

  多态性比较分析,特异片段回收克隆分析。

(一) 基因组DNA提取和纯化
A 、参考实验一的大量提取DNA实验方法,

B、DNA的纯化:用0.8%琼脂糖凝胶(含EB0.5µg/ml)电泳检测片段大小,取出其中的1/3已提取的基因组DNA进行纯化,首先用TE缓冲液补满至总体积50ul,再等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次, 离心吸上清液于Eppendorf管中,加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇,-20℃放置2h以上,10000g离心10min,用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ,风干后溶于30μlTE缓冲液中,UV-2401PC(岛津)紫外分光光度计检测A260、A280值并定量,再用0.8%琼脂糖凝胶(含EB0.5µg/ml)电泳检测片段大小。

注:0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶,0.5g组织,溶液E可增加至300ul,此时DNA浓度大约为100ng/ul。
(必发365娱乐:admin)

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