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脑利钠肽检测方法及其在心血管疾病中的应用进展

2015-01-05365必发娱乐:365必发娱乐 阅读: 【字号:
导读: BNP由于其生物学特征及重要的临床应用价值,近年来受到广泛关注。现将其生物学特性、检测方法及其在心血管疾病诊断、治疗中的应用进展综述如下。

南京医科大学检验系 童华诚(综述)潘世扬(审校)

关健词: 脑利钠肽(BNP),心力衰竭(HF), 左心室功能不全(LVD) 1981年de Bold 等从鼠的心房组织中发现了一种具有利尿、利钠、扩张血管作用的物质,并于1984年鉴定出这种由心房肌细胞分泌的多肽激素物质,命名为心房利钠肽(ANP),又称心钠素[1]。1988年科学家从猪脑组织中提取出脑利钠肽(Brain Natriuretic Peptide, BNP)。但随后的研究发现,这种多肽物质主要来源于心室肌组织,其分子结构与28个氨基酸构成的ANP相似,均包含一个17氨基酸组成并通过两个半胱氨酸之间的二硫键连接成的环状多肽结构[2]。此外,人体第三类利钠肽即C型利钠肽是血管内皮细胞分泌释放的激素,其确切功能尚待进一步研究,但有血管扩张特点[3]。

BNP由于其生物学特征及重要的临床应用价值,近年来受到广泛关注。现将其生物学特性、检测方法及其在心血管疾病诊断、治疗中的应用进展综述如下。

1. BNP生物学特性

脑利钠肽又称B-型利钠肽(B-type Natriuretic Peptide, BNP)是主要由心室肌细胞分泌的心脏激素,为32氨基酸组成的多肽片段,其氨基酸序列在不同物种间呈现高度保守性[2]。

人ANP和BNP基因定位1号染色体短臂远端,心肌细胞内这两种基因表达受锌指结构序列组件GATA4和GATA6调控。BNP反转录脱氧核糖核酸(cDNA)由1900个核苷酸组成,含有3个外显子和2个内含子。在5,端和3,端各含一个488bp和247bp的非编码区,其中5,端侧翼含2个“GATAAA”盒,3,端终止密码后70bp-100bp处有3个“TATTTAT”重复序列。心房、心室肌细胞均有BNP基因表达,而心室肌细胞ANP基因表达,在出生后几周内迅速下调,因此,成人心脏ANP的分泌是具有心房特异性的[1,2]。心房肌细胞合成ANP后储存于细胞内,受刺激后以一种囊泡介导的主动分泌方式释放至细胞外液中.ANP主要对细胞外液容量的变化作出快速反应。ANP合成后储存于心房肌细胞内,对刺激作出反应时,主要从储存池中释放出来,仅有少部分来源于新合成的激素。所以,ANP释放的调控主要在激素分泌水平并且ANP储存量往往在ANP mRNA转录激活前急剧减少。与ANP不同,BNP合成和分泌的调节主要在基因表达水平上进行。尽管BNP也可见存在于某些心房和心室肌细胞分泌颗粒中,但BNPmRNA转录速度要快得多。BNP基因包含不稳定的“TATTTAT” 核苷酸序列,提示BNPmRNA表达活性高,BNP合成、分泌呈爆发式。在心肌细胞内首先合成其激素原前体,经裂解去除一个26氨基酸的信号肽,以含108氨基酸的激素前体pre-proBNP形式分泌至细胞内,但pre-ProBNP在何处裂解为活性形式BNP-32(77~108位氨基酸)及其氨基端片段NT-ProBNP(1~76)至今尚未完全清楚。BNP在循环血液中的生物半衰期约为23分钟。BNP似乎不像ANP一样在心肌细胞有一定程度的储存,因此,BNP释放增加意味着合成加速。病理状态下BNP主要来源于心室肌细胞,左心室收缩强度增加或容量负荷压力增大是BNP生成和释放的主要调节因素[4,5]。

人体组织中广泛分布着三种不同的利钠肽类激素受体,分别为NPR-A、NPR-B和NPR-C,均为跨膜受体。其中NPR-A在大血管内皮细胞中最为丰富,对ANP亲和力最强,是其对BNP亲和力的10倍。NPR-B主要分布在大脑,也见于血管平滑肌组织,对CNP亲和力最强。ANP或BNP与相应受体结合后导致细胞内cGMP生成增加。cGMP作为第二信使,促进相关蛋白激酶、磷酸二酯酶和离子通道的激活,从而激发相应的生物活性作用。关于BNP增长抑制效应的信号特导性传导通道还未完全阐明,可能与某些有丝分裂原激活蛋白激酶的信号级联反应机制有关。NPR-C是体内含量最丰富的一类受体,主要分布于肾和血管组织,NPR-C是一类起清除作用的受体,当BNP与NPR-C结合后,通过受体介导的吞噬作用,最终在细胞内被溶酶体酶溶解失活,受体本身又返回到细胞表面。BNP较ANP对NPR-C的亲和力低,因此,其生物半衰期期约23分钟,是ANP(约3分钟)的7~8倍。NT-ProBNP生物半衰期大约为1-2小时,这也解释了心衰患者血液中NT-ProBNP浓度高于BNP的原因。BNP还可以通过酶促反应被降解清除,体内有一种中性肽链内切酶(NEP),是一种含锌(Zn)的金属肽激酶,对ANP和BNP均有高亲和力,可促进BNP从循环中被清除[6,7]。

BNP生物活性作用主要包括[7]:(1)BNP可通过不同机制来影响循环系统血压,拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用以及反馈调节脑部心血管中枢的活动,降低迷走神经传出冲动阈值从而抑制心搏过速反射和血管收缩,并能增加冠状动脉和肾血流量。(2)BNP通过抑制肾小球入球小动脉球旁器的致密斑释放肾素,抑制肾上腺皮质球状带细胞合成和释放醛固酮,提高肾小球滤过率和促进排尿。其利钠、利尿作用还因肾远曲小管增加水、钠排泄和减少集合管对水、钠的重吸收而进一步加强。当心衰 、肾衰 、肝硬化腹水等吸收体液或盐过多产生水肿性紊乱导致心房或心室容量负荷增加、侧壁压增高时,利钠肽类激素释放??多。(3)降低全身及肺血管阻力和全身及肺血管血压(前负荷),降低静脉回流量(后负荷),降低心房、心室舒张未期压力等,提高心输出量和改善舒张功能。(4)调控心血管细胞增生和肥大的进程。阻断ANP,BNP基因表达或ANP,BNP与受体结合则导致血压增高和心肌肥大并继发肾对容量负荷的反应性受损。BNP还被认为是来源于心肌细胞的抗纤维化因子[8]。

2.BNP检测方法及影响因素

目前对BNP的检测通常运用抗BNP单克隆或多克隆抗体建立起来的免疫学测定方法。一般使用两株匹配的抗体,其中一株可以识别BNP分子的C—端区,另一株识别分子内环结构,分别作为捕获抗体和检测抗体。另一些方法则是通过检测BNP前体氨基端片段 NT-ProBNP血浆浓度来研究其变化与疾病的关系。2001年11月美国FDA批准了第一个BNP检测试剂盒(Biosite  Dignostics)在美国上??,从而使BNP检测有可能成为临床实验室常规测定项目,该方法目前主要用于对心衰的诊断和分期[10]。

BNP的免疫学测定方法有放射免疫法(RIA)、高灵敏度的免疫放射法(IRMA),酶免疫法(EIA),微粒子酶免疫法(MEIA),免疫荧光法(FIA)等。EIA及RIA法测定BNP时,血浆标本均须经过抽提浓缩10倍以上,需要1毫升以上血浆标本,并且反应时间长达18-24小时,不适于常规操作。且RIA法有放射性污染问题,有一定局限性。IRMA法准确敏感,但亦较为费时费力,须经过温育过夜的实验步骤,自动化程度不高,也存在放射性I125对环境及操作人员的损害[11,12]。

BNP及其激素前体氨基端片段 NT-ProBNP检测方法近年来不断优化,自动化程度日益提高,成为简单、适用的常规方法。其中,TRIAGE分析仪是Biosite公司提供的手提式测定仪,采用免疫荧光法测定全血或血浆BNP水平,测定方法很简单,在层析板的加样区加入250ul全血或血浆,渗入反应区后与鼠抗人BNP荧光抗体结合,仅需15-30分钟,即可测得结合物的荧光强度及BNP浓度。该法检测的线性范围可达5~1300pg/ml, 测定值与其它方法相关性良好,是一种快速的床旁试验方法(POCT)[10]。 Abbott  AxSym  BNP检测法是一个新的全自动免疫化学分析法,采用BNP特异的单克隆抗体和二步夹心分析技术测定血浆BNP水平。样品中的BNP被包被在乳胶微粒子颗粒上的抗-BNP抗体捕获,微粒子在纤维网上进行清洗分离,结合在纤维网上的BNP再与碱性磷酸酶标记的另一株单抗结合。通过对荧光底物磷酸-4-甲基伞型酮催化反应所发出的荧光信号进行检测,和已知浓度的标准物荧光信号强度进行比较,可得到待测样品中BNP浓度。本法检测范围可达0~4000pg/ml,变异系数小于7.6%。分别用Abbott AxSym BNP和Biosite Triage BNP对150例血浆标本进行测定,两法相关系数为0.95,斜率为0.94,说明两者之间有极好的相关性[12]。

最近Roche推出了NT-proBNP测定试剂盒,利用两种多克隆抗体,分别在氨基酸1- 21和氨基酸39–50,直接抗 NT-proBNP,采用夹心法免疫分析和电化学发光技术测定样本NT-proBNP浓度,检测线性范围5 - 35,000 pg/ml,总变异系数 2.2 - 5.8 % ,与BNP, ANP, CNP的交叉反应< 0.001% ,也是一种全自动分析方法,整个测定过程可在30分钟内完成[13]。

人外周血中BNP水平随年龄变化而改变,75岁以上非心衰老龄人血液BNP平均水平较45岁以下人群升高可达1倍以上。同时存在在男、女性别间的差异,正常人群中同年龄段的女性较男性稍高。样品采集应该在受试者安静状态下进行,将所采集的静脉血(约3~4ml)置于EDTA抗凝的塑料管内;在室温下,必须于2~4小时内测定完毕。若样品在2~8℃条件下储存,则放置时间可延长到24小时,如果标本需要保存1个月以上,则需将血浆分离后,放置于-20℃以下的冰柜中保存。文献指出,室温下用抗凝全血测定BNP应在标本中加入适量抑肽酶 ,否则测定值会偏低。饱食、运动、情绪激动状态、体位和姿势、服用某些药物等均会对测定结果产生影响,因此应强调在标准条件下采集血液标本。标本不宜用玻璃试管收集,不推荐使用血清及或其他抗凝剂如肝素锂等[14] 。

各种市售BNP测定试剂盒由于使用的抗原标准品,单抗来源以及抗体所针对的BNP、ProBNP抗原决定簇不同,这些检测方法在灵敏度、特异性等方面存在差异。由于不同实验室对同一份样品的测定值不一致,对判断测定值的临床意义造成了困难[8-11]。因此,首先应针对各种测定方法建立相应的正常人及各种病理状态下的测定参考值范围。就目前的现状而言,BNP检测方法的标准化还有很长的路要走。

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